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一氧化氮 (Nitric oxide ，NO) 含量測定試劑盒說明書微量法 |
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一氧化氮 (Nitric oxide ，NO) 含量測定試劑盒說明書 微量法 注意：正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。 測定意義： NO (Nitric Oxide ，NO) 廣泛分布于生物體內(nèi)神經(jīng)、循環(huán)、呼吸、消化、泌尿生殖等系統(tǒng) 中，特別是神經(jīng)組織中較豐富。它作為細胞間及細胞內(nèi)的信息物質(zhì)，發(fā)揮信號傳遞的作用，是 一種新型的生物信使分子，在機體的生理、病理過程中起著重要的作用。 測定原理： NO在體內(nèi)或水溶液中極易氧化生成 NO2-，在酸性條件下，NO2-與重氮鹽磺酸胺生成重氮 化合物，進一步與萘基乙烯基二胺偶合，產(chǎn)物在550nm處有特征吸收峰，測定其吸光值，可以 計算NO含量。為了排除樣品色素等的影響，每個樣品需做對照管。 自備實驗用品及儀器： 天平、研缽或勻漿器、可見分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96 孔板、蒸餾水。 試劑組成和配制： 提取液：液體 100mL×1 瓶，4℃保存。 試劑一：液體 3mL×1 瓶，4℃避光保存。 試劑二：液體 3mL×1 瓶，4℃保存。 試劑三：液體 6mL×1 瓶，4℃避光保存。 樣品處理： 1. 組織：按照組織質(zhì)量 (g) ：提取液體積(mL)為1：5~ 10的比例 (建議稱取約0. 1g組織，加入 1mL提取液) 進行冰浴勻漿。10000g ，4℃離心 15min ，取上清，置冰上待測。 2. 細菌、真菌：按照細胞數(shù)量 (104個) ：提取液體積 (mL) 為500~ 1000：1的比例 (建議500 萬細胞加入1mL提取液) ，冰浴超聲波破碎細胞 (功率300w ，超聲3秒，間隔7秒，總時間 3min ) ；然后10000g ，4℃ ，離心 15min ，取上清置于冰上待測。 3. 體液和培養(yǎng)液等其它液態(tài)樣品：直接測定。 測定步驟和操作表： 1 、 分光光度計或酶標儀預熱30min 以上，調(diào)節(jié)波長至550nm。 2 、 操作表
NO 含量計算： a. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下 標準曲線回歸方程為：y=0.016x-0.0103 ，R2=0. 9986 1 、組織樣品： NO含量定義：25℃時，每克樣品或每毫克蛋白15min生成1μmoL NO2-，相當于1μmoL NO。 (1) 按樣本質(zhì)量計算 NO 含量 (μmoL/g) = (A 550 +0.0103) ÷0.016×V 反總÷ (V 樣÷V 樣總×W) ×10 -3 = 0. 125× (A 550 +0.0103) ÷W (2) 按樣本蛋白濃度計算 NO 含量 (μmoL/mg prot) = (A 550 +0.0103) ÷0.016×V 反總÷ (V 樣×Cpr) ×10 -3 = 0. 125× (A 550 +0.0103) ÷Cpr 2 、其他樣品： NO 含量定義：25℃時，每升樣品15min生成 1μmoL NO2- ，相當于1μmoL NO。 NO 含量 (μmoL/L) = (A 550+0.0103) ÷0.016×V 反總÷V 樣 = 125× (A 550+0.0103) V 反總：反應(yīng)總體積，0.2mL；V 樣：反應(yīng)中樣品體積，0. 1mL；V 樣總：加入提取液體積， 1mL；W：樣品質(zhì)量，g；Cpr：蛋白濃度，mg/mL b. 用 96 孔板測定的計算公式如下 標準曲線回歸方程為：y= 0.008x-0.0103 ，R2=0. 9986 1 、組織樣品： NO含量定義：25℃時，每克樣品或每毫克蛋白15min生成 1μmoL NO2-，相當于1μmoL NO。 (1) 按樣本重量計算 NO 含量 (μmoL/g) = (A 550 +0.0103) ÷0.008×V 反總÷ (V 樣÷V 樣總×W) ×10 -3 = 0.25× (A 550+0.0103) ÷W (2) 按樣本蛋白濃度計算 NO 含量 (μmoL/mg prot) = (A 550+0.0103) ÷0.008×V 反總÷ (V 樣×Cpr) ×10 -3 = 0.25× (A 550+0.0103) ÷ Cpr 2 、細胞 NO 含量定義：25℃時，每104個細胞15min 生成 1μmoL NO2- ，相當于1μmoL NO。 NO 含量 (μmol/104cell) = (A 550+0.0103) ÷0.008×V反總÷ (V樣÷V樣總×細胞數(shù)量) ×10 -3= 0.25× (A 550+0.0103) ÷細胞數(shù)量 (萬個) 3 、 其他樣品： NO 含量定義：25℃時，每升樣品 15min 生成 1μmoL NO2- ，相當于1μmoL NO。 NO 含量 (μmoL/L) = (A 550 +0.0103) ÷0.008× V 反總÷V 樣= 250× (A 550 +0.0103) V 反總：反應(yīng)總體積，0.2mL；V 樣：反應(yīng)中樣品體積，0. 1mL；V 樣總：加入提取液體積， 1mL；W：樣品質(zhì)量，g；Cpr：蛋白濃度，mg/mL 注意事項： 1. 試劑盒 2-8℃保存。 2. 盡量使用新鮮樣品進行檢測，試劑三有腐蝕性，操作時請做好防護措施。 3. 若檢測出得 OD 值在標準曲線范圍外，請將樣品進行適當?shù)臐饪s或稀釋，并在計算公式 中除以濃縮倍數(shù)或者乘以稀釋倍數(shù)。 4. 最DI檢出限為 0.65μmoL/L。 從2011年開始我們致力于在生命科學領(lǐng)域、生物醫(yī)學實驗技術(shù)及論文潤色服務(wù)，協(xié)助客戶各類實驗服務(wù)及論文潤色十余年，是客戶您值得信賴的科研合作伙伴! 如果您受時間、試驗條件等限制而無法完成您的課題研究，歡迎您與我們聯(lián)系。
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